Liquidversustissuebiopsyfordetectingacquiredresistanceandtumorheterogeneityingastrointestinalcancers
NatureMedicine
背景
靶向治疗中获得性耐药不可避免，几项重点研究表明肿瘤异质性是患者耐药的潜在诱因。获得性耐药中，治疗带来的进化压力会驱动患者个体的不同病灶或同一病灶的不同亚克隆生长，从而获得不同的耐药机制。
在疾病进展过程中，标准单病灶组织活检的基因分析一直是确定获得性耐药机制的主要方法，但近期研究表明组织活检可能大大地低估了患者个体的耐药异质性。特别是对单转移灶单区域的核心活检分析可能无法发现临床相关的耐药机制，从而导致后续治疗的失败。液体活检，特别是cfDNA（细胞游离DNA）在肿瘤异质性评估中具有优势，能够识别多重并发耐药机制。
尽管有一些病例报告和小规模的案例研究表明液体活检的优势，但是现阶段还没有大规模的靶药治疗后进展的前瞻性队列研究用于直接比较cfDNA和组织活检技术。本研究对42例靶药治疗进展的胃腺癌患者进行前瞻性研究，用于直接比较cfDNA与组织活检技术。研究发现，cfDNA较组织活检更能有效识别多种临床相关的耐药突变和耐药机制。本研究中有78%的患者cfDNA检测到组织活检中未发现的耐药突变。研究还通过多节点cfDNA取样，结合多组织样本和解剖样本基因检测结果阐明了病灶之间的地理与进化差异。本研究结果表明，高度异质性是获得性耐药的重要特征，个体中多重并发耐药突变的发生不是“特例”而是“必然”；cfDNA在获得性免疫机制研究中较组织活检有优势。
方法
1.样本
42例靶向治疗获得性耐药的胃腺癌患者，分布于3个癌种7个分子亚型中，采样节点和样本情况如图。
2.测序所有样本均进行靶向捕获测序（Guardant76基因panel和IRCC基因panel），肿瘤细胞含量5%且有样本剩余时进行全外显子测序。3.分析软件MuTect、Strelka、deTiN、ContEst4、ABSOLUTE、PhylogicNDT。结果
结果-1cfDNA与组织活检耐药突变检出对比，78%患者cfDNA检出了组织未检出的耐药突变
对42例胃腺癌患者进展后的血浆进行靶向测序。共78个与临床相关的耐药突变被检出；76%（32/42）患者的进展后cfDNA中检测到至少1个耐药突变，其中，53%（17/32）患者耐药突变数大于1（2~9，中位数3），表明获得性耐药的现象比较常见，且存在肿瘤异质性。
对23例可以获得进展后的组织的患者进行靶向测序。组织活检，48%（11/23）患者检出耐药突变，对比cfDNA，87%（20/23）患者检出耐药突变，说明cfDNA耐药突变的阳性检出率高于组织活检。只有9%（2/23）患者的进展后组织中检测到多个耐药突变；对比cfDNA，有40%（9/23）的患者检出多重耐药突变，且最高耐药突变数达到9个。
综合来看，78%（18/23）例患者cfDNA检测到组织中未检测到的耐药突变，4%（1/23）例患者组织活检检测到cfDNA未检测到的耐药突变。
只有1例患者，在组织中检出的耐药突变在cfDNA中未检出，该例患者是RAS野生型结直肠癌患者TPS，进行西妥昔单抗治疗。该患者在进展后组织中检出突变EGFRKE（等位基因频率为11.9%，肿瘤细胞含量为0.53%），但未能在进展后的cfDNA中检出该突变。重新对进展后的cfDNA进行ddPCR检测，检出突变EGFRKE，等位基因频率为0.53%（接近临床NGScfDNA的检测下限）。cfDNA与组织活检检测结果对比可知，所有组织检出的耐药突变均能被cfDNA检出。
18例患者cfDNA检出了组织未检出的耐药突变，其中5例患者有后续组织样本或者解剖样本进行NGS测序，检出了cfDNA中检出的耐药突变。
结果-2单案例cfDNA和多组织部位NGS检测结果表明，cfDNA能更好地展示患者耐药突变全景
患者详情：53岁BRAFVE转移结直肠癌患者，使用西妥昔单抗/康奈非尼/阿博利布联合治疗，16个月后疾病进展。进展后，进行肝组织活检发现主克隆BRAFVE和突生突变KRASG12S，cfDNA检测获得所有的BRAFVE耐药突变（KRASG12S、NRASQ61R、EGFRamplification）。随后，病人进行了脑转移组织切除手术。转移脑组织切除手术后，为了全面了解患者的耐药突变机制，对进展后cfDNA、进展后肝组织、脑转移组织切除手术后肝组织及软组织进行全外显子测序。耐药突变（KRASG12S、NRASQ61R、EGFRamplification）检出情况如表格所示，cfDNA中检出了所有的突变，单一部位组织活检无法获得所有的耐药突变。对所有突变进行克隆结构与进化树分析，结果如图b所示。与耐药突变相似，主干克隆和大部分亚克隆在cfDNA中都被检出，说明cfDNA具有突出的应对肿瘤异质性的能力。结果-3单案例进展前后cfDNA和多组织部位NGS检测结果表明，cfDNA不仅能够反应出患者耐药突变全景，还能揭示耐药突变间的进化关系患者详情：58岁转移胃腺癌患者，cfDNA检测到CDD44-FGFR2融合突变，接受FGFR抑制剂Debio治疗，疾病稳定4个月。对患者进行多节点cfDNA取样NGS检测，主克隆RHOAY42C分子负荷初期降低，随后迅速升高，并伴随4种FGFR2突生突变（图a），其中3种为已知的FGFR耐药突变。患者耐药后病情急速进展，最后死亡。对患者进展前后cfDNA、进展后主动脉旁淋巴结和17份解剖组织进行取样检测（见图b-d）。结果发现：a.耐药突变FGFR2VL与FGFR2LV发生部位存在互斥关系，前者主要存在于肝转移灶中，后者主要存在于除肝转移灶外的其他转移灶中；b.原发灶胃组织中没有明确的证据表明存在CD44-FGFR2融合突变，但FGFR2基因表达值显著降低。结合进化树分析，表明融合突变CD44-FGFR2是癌症发展后期产生的，该结果与FGFR2融合事件发生在胃癌晚期的生理学特性一致（ERBB2，MET等受体酪氨酸激酶基因的扩增一般发生在胃癌晚期）。在原发灶中，检测到低频FGFR2耐药突变，说明可能存在FGFR2阳性突变，但频率低于WES和RNA-seq的检测下限导致未被检出；c.三个耐药突变以及大部分组织特有突变均在cfDNA中被检出，再次说明cfDNA对于多重并发耐压机制的发现具有重大意义。结论与讨论
本研究结果表明，单一部位单一组织活检不能充分识别患者的临床耐药机制，而cfDNA能识别78%的患者的单一或多重并发耐药机制，故cfDNA检测对患者后续治疗方案的选择具有重要意义。
患者可能由于多个亚克隆导致的不同耐药机制，选择耐药后治疗策略时必须对患者的耐药机制有很全面的了解。已有研究表明了cfDNA在初治患者靶向用药指导中的有效性、类似地，本研究结果又证实了cfDNA在对治疗后进展的患者评估和克服获得性耐药方面的重要作用。
局限性
尽管是目前最大规模的液体活检与组织活检对比研究，总体病人数仍然很有限，需要更进一步的研究来确定获得性耐药的异质性程度，并在其他癌种中证实获得性耐药的异质性。
对比临床特征相似的单独标准化疗后进展队列，cfDNA检测并未发现任何耐药突变，表明本研究中的耐药突变可能是在靶向治疗压力下定向选择而产生的。
cfDNA并不能检测到非遗传型的耐药机制，24%的患者通过cfDNA和组织活检检测不到耐药突变。
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